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Im Zentrum der Serie stand der FBI-Special Agent Fox Mulder, der mit der Aufklärung der sogenannten X-Akten beauftragt war. Dahinter verbargen sich die Fälle des FBI, die ungeklärt blieben und meist mit übernatürlichen Phänomenen verbunden waren. Mulder selbst war für diese Geschichten sehr empfänglich, glaubte er doch an die Existenz von außerirdischem Leben, seit seine Schwester im Kindesalter von Außerirdischen entführt wurde. Die Ermittlungen des engagierten Agenten waren jedoch der Regierung ein Dorn im Auge, da er dabei auch immer wieder auf geheime Regierungsaktionen stieß. Aus diesem Grund teilte man Mulder zu Beginn der Serie Special Agent Dana Scully, gespielt von Gillian Anderson, zu. Die von Natur aus skeptische Naturwissenschaftlerin sollte Mulder überwachen und ihren Vorgesetzten regelmäßig Bericht erstatten.
Im Laufe ihrer Zusammenarbeit schweißte sich das Team immer mehr zusammen und auch Scully musste ihre Skepsis immer wieder ein Stückweit aufgeben. Schließlich wurde sie im Laufe der Zeit selbst von Außeririschen entführt, wodurch sie Krebs bekam und empfing ein Baby von Außeririschen, das bereits kurz nach der Geburt telepathische Fähigkeiten zeigte.
Die einzelnen Episoden der Serie ließen sich grob in zwei Kategorien unterteilen. Es gab auf der einen Seite die klassischen Ermittlungsfolgen, bei denen Scully und Mulder ein unerklärliches Phänomen untersuchten. Die Ermittlungen führten sie meist in eine abgelegene amerikanische Kleinstadt. Der Fall konnte oft nicht abschließend geklärt werden, da es entweder keine schlagkräftigen Beweise gab oder diese verschwanden. Der andere Teil der Episoden beschäftigte sich mit der riesigen Verschwörung um eine geheime Alien-Invasion und die Züchtung von Alien-Mensch-Hybriden. Vor allem bei diesen Episoden trafen die Ermittler auf die legendären Nebenfiguren wie der Krebskandidat, Mr. X oder die einsamen Schützen.
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Der Erfolg der Serie führte auch zu zwei Kinofilmen. Der erste, der in Deutschland den schlichten Titel «Akte X – Der Film» trug, entstand im Jahr 1998 und war in die Handlung der Serie zwischen Staffel fünf und sechs eingebettet. Der zweite Film mit dem deutschen Titel «Akte X – Jenseits der Wahrheit» entstand erst im Jahr 2008 – also bereits nach dem Ende der Serie - und vereinte erneut David Duchovney und Gillian Anderson.
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